你是否因为不会写实验报告而苦恼？小编给您整理这份柱层析实验报告范本，帮助您轻松地完成实验报告的撰写。详细介绍了柱层析实验的实验步骤与结果分析，希望你能快速撰写出高效且规范的实验报告，展现学术才能。
柱层析实验报告1
柱层析实验报告柱层析分离色素
一、【实验目的】
1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。
2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。
二、【实验原理】
叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、
胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利
用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。
吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。
本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。
三、【实验材料】
原料：
新鲜的菠菜叶
试剂：
1．无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝
2．石英砂6．饱和氯化钠溶液
3．丙酮7.水硫酸钠
4．石油醚（60-90℃）8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材：层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台
四、【实验操作】
1．色素的提取：
20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，
滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤
液，转移至分液漏斗中,再加入40
毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20
毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干
燥5分钟，备用.
2．样品的浓缩：
将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8毫升左右，以备加样使用。
3．层析拄的制备：
15克碱性三氧化二铝加入30毫升石油醚搅拌，浸泡10min.。在层
析拄内加入一团棉花在底部，再加入石英砂0.5cm以上，然后用石油醚半充满柱子，再
将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内，倒时应该缓慢，重复使用下面的石油醚，直到装完。用石
油醚洗柱内壁，顶部加一小团棉花，然后再填入石英砂0.5厘米高。
3．样品的分离层析：吸附层析分离色素打开层析拄下部开关，向拄内加入2毫升浓缩液，至液体没入砂内，再加入石油醚冲洗拄壁，液体浸入砂内，加洗脱液开始层析，可以看到不同色带如图片
1，直至第一条色带洗脱完毕，在拄下面用试管接收第一条色带的洗脱液，如图片2。
五、【实验结果】
实验结果如下图：图一：层析柱中出现黄色带图二：提取出的黄色胡萝卜素结果分析：
洗脱过程中，首先有一条黄色的色带圈沿着层析柱下移，色带圈的各个方向的移动速度
并不是完全相同，原因在于层析柱的制作过程并不完全均一，使层析柱内部不均匀，以至于
色带各方向的移动速度不同。最后收集得到亮黄色的胡萝卜素。
七、【注意事项】
1、萃取时不要剧烈振荡，以防止发生乳化现象。
2、为了保持柱子的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的，否则当柱中溶
剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗透和显色的均一性。因此要保证整个装样过程中
溶剂要高于三氧化二铝的表面。
3、在吸附剂上端加入脱脂棉（或滤纸）是使加样品时不致把吸附剂冲起；在吸附柱下端
加脱脂棉（或沙子）可以防止吸附剂细粒流出。
4、层析柱填装紧密与否，对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀，会影响渗透速度和
显色的均匀。
6、洗脱流速不宜过快，避免因此压紧凝胶，色素分离不开；也不要过慢，使柱装得太松，
导致层析过程中，凝胶床高度下降，色素洗脱很慢。因此应控制洗脱流速，以每分钟60~80
滴为宜。
7、样品一定要足够浓缩，加样量不要过大，过大，分离条带过宽，如果层析拄不够长，
各组分不易分开，易同时洗脱下来；加样量过少，色带不是很清楚，不易观察，效果不好。
8、层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要选择。一般来说，细长的柱分离效果
较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发
生“管壁效应”，即柱管中心部分的组份移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越
好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。
八、【实验小结】
在该柱层析分离色素实验中，我了解了柱层析技术的相应方法和原理，学会了层析柱的
制作和准备，进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质、洗脱液的配比、层析柱
的制作及洗脱液的流速是本实验成功与否的三大关键因素。知识拓展：
1、溶剂的选择：
（1）吸附剂要求较纯，否则会影响样品的吸附和洗脱。
（2）溶剂和吸附剂不能起化学反应。
（3）溶剂的极性应比样品小，如果大了，样品不宜被吸附剂吸附。
（4）溶剂对样品的溶解度不能太大，否则影响吸附，但也不能太小，溶液的体积增加，易使色谱分散。
（5）可使用混合溶剂，如有的组分含有较多的极性基团，在极性小的溶剂中溶解度太小。也可选用极性大的溶剂溶解，然后加入一定量的非极性溶剂。这样既降低了
极性，又减少了溶液的体积。
2、洗脱剂的选择：
样品吸附在氧化铝柱上后，用合适的溶剂进行洗脱，这种溶剂称为洗脱剂。如果原来用
于溶解样品的溶剂冲洗柱不能达到分离的目的，可以改用其他溶剂，一般极性较强的溶剂影
响样品和氧化铝之间的吸附，容易将样品洗脱下来，达不到分离的目的。因此常用一系列极性渐次增强的溶剂，既先使用极性最弱的溶剂，然后加入不同比例的极性溶剂配成洗脱溶剂。常用的洗脱溶剂的极性按如下次序递增。己烷和石油醚＜环己烷＜
四氯化碳＜三氯乙烯＜二硫化碳＜甲苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜丙醇＜
乙醇＜甲醇＜水＜吡啶＜乙酸。篇二：实验六：薄层层析与柱层析实验六薄层层析与柱层析实验目的
1. 了解偶氮苯的光学异构反应，加深对光化学反应的理解。
2. 掌握薄层层析的基本操作,薄层
层析分离顺、反式偶氮苯。
3. 了解柱层析分离有机化合物的原理，初步掌握层析柱装填和洗脱的操作方法
4. 采用柱层析分离反式偶氮苯与靛红的混合物实验原理偶氮苯是最简单的芳香偶氮化合物，众多偶氮染料的母体结构。含有两个苯基分别与偶
氮基–n=n–两端相连的结构。偶氮苯有毒，易燃。偶氮苯有顺（z）-反（e）-异构体。反式
为橙红色棱形晶体，蒸气为深红色，溶于乙醇、乙醚、醋酸和水。反式的热力学性质稳定。
当溶于乙醇的偶氮苯用一定强度的紫外光照射时，顺式的比例逐渐增大，直至达到平衡，形
成顺反异构体的混合物。偶氮苯的光致异构是很多偶氮类功能材料光响应的基础。顺式为橙
红色片状晶体，不稳定，在加热或可见光照射下能够变成反式。色谱方法是通过在固定相和流动相间分配的不同而将物质分离开。待分离混合物各组分在固定相上的吸附强度不同，与流动相一起移动的速度也不同，因此被分离开。薄层色谱属于固-液吸附色谱。薄层色谱板中的固定相中的微孔结构使得溶剂在毛细管作
用下能够沿着色谱板向上移动。由于混合物中各组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，
当展开剂（流动相）流经吸附剂时发生无数次吸附解附过程，吸附力弱的组分随流动相迅速
向前移动，吸附力强的组分滞留在后，由于各组分具有不同的移动速度，最终在固定相薄层析上分离。tlc除了用于分离外，还可
以通过与已知结构的的化合物比对，鉴定少量有机混合物的组成，它也是柱色谱寻求最佳展
开剂的手段。上图中红色化合物的rf等于竖直红线的长度除以竖直蓝线的长度。柱层析也属于固-液吸附色谱。在一根玻璃“分离柱”中进行。管中装上适当的粉末作为
国定相。待分离或纯化物质的溶液（流动相）在重力作用下流经吸附剂时，不同物质对溶剂
和吸附剂的亲和力不同，因而被吸附的程度不同，从而以不同速度流动，使化合物得以分离。
靛红与偶氮苯在极性上具有较大差异，从而可以使用极性适中的展开剂，通过柱层析将二者
分离。
仪器与试剂
分析天平，tlc，锥形瓶，毛细管，层析柱，棉花，量筒，硅胶，蒸发皿，展缸；etoac,
ch2cl2, 石油醚，靛红；请自带尺子（用于计算rf值）颜老师在实验开始之前已经准备好的试剂：a. 偶氮苯的溶液（15 mg in 1ml etoh）；b.
靛红的溶液（15 mg in 1ml ch2cl2）；
c. 靛红与偶氮苯的均匀混合物（靛红1.4 g + 偶氮
苯3.5 g）。
实验内容
a) 光照异构化
取0.1 g反式偶氮苯溶于5 ml无水乙醇中，将此溶液放于试管中，密封，置于可见光下
二星期，以便与光照前的溶液进行对比。b) 薄层层析
取管口平整的毛细管吸取光照后的偶氮苯溶液，在离薄层板边沿约0.5 cm 的起点线上点
样。再用另一毛细管吸取未经光照的反式偶氮苯溶液点样。待乙醇挥发后，将点好样品的薄
层板放入内衬滤纸的展缸中。展缸内已放置展开剂（乙酸乙酯/石油醚
=1/40）。薄层板的点样端在下方，浸入展开剂，展开剂不要没过起点线，也不要碰到样品点。待展开剂前沿上升到离板的上端约1 cm处时，取出薄层板，立即用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，置于空气中晾干。可观察到薄层板上经光照后的偶氮苯溶液点样处上端有两个黄色斑点（哪一个斑点是顺式的？哪一个斑点是反式的？）。计算异构体的rf值。用上述相同的方法，采用ethylacetate : petroleum ether = 1:1为展开剂，对靛红与偶氮苯的混合物进行tlc，为下面的柱层析选择展开剂。c) 柱层析
1．将层析柱固定在铁架台上，一定要保持柱子竖直。
2．将层析柱洗净后在柱底部放入一小团脱脂棉花。
3．在锥形瓶中称重7g 硅胶（sio2），并用ethyl acetate : petroleum ether (1:40)调匀。在层析柱的下方放置一个锥形瓶，以收集流下的液体。加入少量洗脱剂于层析柱中，以润湿棉花，使其贴在柱子下端。
4．打开层析柱活塞，控制溶剂下流，将硅胶悬浊液沿柱子侧壁加入，并用少量的溶剂洗去残余的硅胶，并加入柱中。用装有橡皮管或塞子由下向上轻轻敲击柱子外壁，将气泡赶出，使硅胶填装均匀。并加压使硅胶紧密，以获得较好的分离效果。轻轻敲击，使硅胶最上层成均匀平面，然后用药匙沿柱子侧壁，轻轻地、慢慢地在硅胶表面覆盖一层海砂（注意：不要破坏硅胶
的上平面）。关闭活塞，备用。
5．打开活塞，当溶剂液面降至海砂表面时，关闭活塞。用滴管沿柱子侧壁加入靛红与偶氮苯混合物的溶液（称取40 mg，置于1.5ml的塑料样品管，加入1 ml二氯甲烷（ch2cl2），超声振荡使其溶解）。打开活塞，使溶剂液面降至海砂表面，关闭活塞。再用少量的展开剂洗塑料样品管，加入层析谱中，
并注意洗去粘附在柱壁上的液滴，打开活塞，流到液面，关闭活塞。重复上述操作，直到将
所有化合物冲到硅胶里面。
6．沿侧壁加入大量的洗脱剂ethyl acetate : petroleum ether (1:40)，打开活塞，加压保持一定的流速，观察色带的形成和分离。
7．当第一个有色带到达柱底时，并且没有流出之前，关闭活塞，倒空锥形瓶，打开活塞，收集全部色带。然后，改用ethyl acetate : petroleum ether (1:1) 作为洗脱剂。关闭活塞，换一个空的且干净的锥形瓶，打开活塞。当第二个有色带到达柱底时，并且没有流出之前，关闭活塞，倒空锥形瓶，打开活塞，收集全部色带。柱层析分离结束。
8．柱层析分离结束后，采用tlc对上述分离的两个溶液进行分析，总结分离效果。同时，打开层析柱活塞，在加压下让展开剂流干，然后将硅胶倒入指定的固体废物桶中。切勿倒入水槽或普通垃圾桶。预习时的问题
1.在薄层层析实验中，为什么点样的样品斑点不可浸入展开剂的溶液中？为什么进行薄
层层析时展缸要盖上盖？
2.当用混合物进行薄层层析时，如何判断各组分的在薄层板上的位置？靛红与偶氮苯，
哪一个的极性较强？为什么？
3.柱层析时柱中若留有空气或者是填装不均匀，对分离效果有何影响？如何避免？
4.偶氮苯和靛红物理化学性质？毒性？有什么应用？偶氮苯光照异构化的机理？why is
trans-azobenzene more stable than cis-azobenzene? 其它阅读材料
1.光化学
由光的作用引起的化学反应近年来日益受到人们的重视，光合作用就是最重要的光化学
反应。研究激发态分子化学行为的光化学反应已经成为有机化学的一个重要分支。光不仅可
以引起多种多样的化学反应，合成各种前所未有的奇妙反应分子，而且与我们的日常生活及
生命现象有着密切的联系。
2. 薄层色谱
1. 固定相的选择
氧化铝和硅胶是薄层层析色谱常用的固定相。氧化铝多用于分离碱性或中性有机物；而
硅胶的吸附性源于表面的si-oh基，主要用于分离酸性、中性有机物质。薄层色谱用的硅胶有薄层色谱用的硅胶有60g、6ogf254、60h、60hf254和
60hf254+366
等类型，其中g表示含有13％硫酸钙（作为黏合剂）；h表示不含硫酸钙；f254表示含有2％
无机荧光物质，在254 nm的紫外光照射下发出绿色荧光。与硅胶相似，氧化铝也因含有黏合
剂或荧光剂而分为氧化铝h、氧化铝g、氧化铝hf254和氧化铝gf254等类型。黏合剂除硫酸钙外，还可用淀粉、羧甲基纤维素
（cmc)。
2. 操作方法
①点样
在薄层板一端约1cm处，用铅笔轻轻划一条作为起点线。样品用易挥发性溶剂溶解后，
用毛细管吸取样品溶液，轻轻接触到起点线的某一位置上。如果溶液太稀，可多点几次，但
要等第一次样品溶剂挥发后，再点第二次。点好样品后，待溶剂挥发干净，才可以进行下面的展开过程。②展开剂的选择选择展开剂，首先应考虑对被分离物有一定的溶解度和解吸能力。由于硅胶和氧化铝都
是极性吸附剂，所以展开剂的极性越大，试样在薄板上移动的距离越远，rf 值（rf值是一个
化合物在薄层板上上升的高度与展开剂上升的高度的比值）越大。例如，在分离过程中常发现rf太小，说明展开剂极性不够，需要考虑加入一种极性强的展开剂进行调控。发现rf值太小，说明展开剂极性不够，需要考虑加入一种极性强的展开剂进行调控。常用展开剂的洗脱力由小到大的顺序为：石油醚、环己烷、四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙醋、丙酮、正丁醇、乙醇、甲醇、水、冰乙酸、吡啶、有机酸等。此外，在展开过程中，展开缸内展开剂的蒸气须始终处于饱和状态。一般可用一块方型
滤纸贴于缸壁上（下端浸于展开剂中），盖好密封一段时间。取放薄层板应迅速。③显色篇三：柱层析知识总结柱层析知识总结
柱层析实验报告2
葡聚糖凝胶层析实验报告
一、实验目的
1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；
2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理
凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排
阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水
体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的
筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出
柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小
分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这
些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶
层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂
1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤
1、装柱
将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让
柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样
装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集
打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测
收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析
1、实验结果：
2、蛋白质样品洗脱曲线：
收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：
流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。
柱层析实验报告3
薄层层析与柱层析
实验目的
1. 了解偶氮苯的光学异构反应，加深对光化学反应的理解。
2. 掌握薄层层析的基本操作,薄层层析分离顺、反式偶氮苯。
3. 了解柱层析分离有机化合物的原理，初步掌握层析柱装填和洗脱的操作方法
4. 采用柱层析分离反式偶氮苯与靛红的混合物
实验原理
偶氮苯是最简单的芳香偶氮化合物，众多偶氮染料的母体结构。含有两个苯基分别与偶氮基-n=n-两端相连的结构。偶氮苯有毒，易燃。偶氮苯有顺（z）-反（e）-异构体。反式为橙红色棱形晶体，蒸气为深红色，溶于乙醇、乙醚、醋酸和水。反式的热力学性质稳定。当溶于乙醇的偶氮苯用一定强度的紫外光照射时，顺式的比例逐渐增大，直至达到平衡，形成顺反异构体的混合物。偶氮苯的光致异构是很多偶氮类功能材料光响应的基础。顺式为橙红色片状晶体，不稳定，在加热或可见光照射下能够变成反式。
色谱方法是通过在固定相和流动相间分配的不同而将物质分离开。待分离混合物各组分在固定相上的吸附强度不同，与流动相一起移动的速度也不同，因此被分离开。
薄层色谱属于固-液吸附色谱。薄层色谱板中的固定相中的微孔结构使得溶剂在毛细管作用下能够沿着色谱板向上移动。由于混合物中各组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，当展开剂（流动相）流经吸附剂时发生无数次吸附解附过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前移动，吸附力强的组分滞留在后，由于
各组分具有不同的移动速度，最终在固定相薄层析上分离。tlc除了用于分离外，还可以通过与已知结构的的化合物比对，鉴定少量有机混合物的组成，它也是柱色谱寻求最佳展开剂的手段。上图中红色化合物的rf等于竖直红线的长度除以竖直蓝线的长度。
柱层析也属于固-液吸附色谱。在一根玻璃”分离柱”中进行。管中装上适当的粉末作为国定相。待分离或纯化物质的溶液（流动相）在重力作用下流经吸附剂时，不同物质对溶剂和吸附剂的亲和力不同，因而被吸附的程度不同，从而以不同速度流动，使化合物得以分离。靛红与偶氮苯在极性上具有较大差异，从而可以使用极性适中的展开剂，通过柱层析将二者分离。
仪器与试剂
分析天平，tlc，锥形瓶，毛细管，层析柱，棉花，量筒，硅胶，蒸发皿，展缸；etoac, ch2cl2, 石油醚，靛红；请自带尺子（用于计算rf值）
颜老师在实验开始之前已经准备好的试剂：a. 偶氮苯的溶液（15 mg in 1ml etoh）；b.靛红的溶液（15 mg in 1ml ch2cl2）；c. 靛红与偶氮苯的均匀混合物（靛红1.4 g + 偶氮苯3.5 g）。
实验内容
a) 光照异构化
取0.1 g反式偶氮苯溶于5 ml无水乙醇中，将此溶液放于试管中，密封，置于可见光下二星期，以便与光照前的溶液进行对比。
b) 薄层层析
取管口平整的毛细管吸取光照后的偶氮苯溶液，在离薄层板边沿约0.5 cm的起点线上点样。再用另一毛细管吸取未经光照的反式偶氮苯溶液点样。待乙醇挥发后，将点好样品的薄层板放入内衬滤纸的展缸中。展缸内已放置展开剂（乙酸乙酯/石油醚=1/40）。薄层板的点样端在下方，浸入展开剂，展开剂不要没过起点线，也不要碰到样品点。待展开剂前沿上升到离板的上端约1 cm处时，取
出薄层板，立即用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，置于空气中晾干。可观察到薄层板上经光照后的偶氮苯溶液点样处上端有两个黄色斑点（哪一个斑点是顺式的？哪一个斑点是反式的？）。计算异构体的rf值。
用上述相同的方法，采用ethyl acetate : petroleum ether = 1:1为展开剂，对靛红与偶氮苯的混合物进行tlc，为下面的柱层析选择展开剂。
c) 柱层析
1．将层析柱固定在铁架台上，一定要保持柱子竖直。
2．将层析柱洗净后在柱底部放入一小团脱脂棉花。
3．在锥形瓶中称重7g 硅胶（sio2），并用ethyl acetate : petroleum ether
(1:40)调匀。在层析柱的下方放置一个锥形瓶，以收集流下的液体。加入
少量洗脱剂于层析柱中，以润湿棉花，使其贴在柱子下端。
4．打开层析柱活塞，控制溶剂下流，将硅胶悬浊液沿柱子侧壁加入，并用
少量的溶剂洗去残余的硅胶，并加入柱中。用装有橡皮管或塞子由下向
上轻轻敲击柱子外壁，将气泡赶出，使硅胶填装均匀。并加压使硅胶紧
密，以获得较好的分离效果。轻轻敲击，使硅胶最上层成均匀平面，然
后用药匙沿柱子侧壁，轻轻地、慢慢地在硅胶表面覆盖一层海砂（注意：不要破坏硅胶的上平面）。关闭活塞，备用。
5．打开活塞，当溶剂液面降至海砂表面时，关闭活塞。用滴管沿柱子侧壁
加入靛红与偶氮苯混合物的溶液（称取40 mg，置于1.5ml的塑料样品
管，加入1 ml二氯甲烷（ch2cl2），超声振荡使其溶解）。打开活塞，
使溶剂液面降至海砂表面，关闭活塞。再用少量的展开剂洗塑料样品管，加入层析谱中，并注意洗去粘附在柱壁上的液滴，打开活塞，流到液面，关闭活塞。重复上述操作，直到将所有化合物冲到硅胶里面。
6．沿侧壁加入大量的洗脱剂ethyl acetate : petroleum ether (1:40)，打开活
塞，加压保持一定的流速，观察色带的形成和分离。
7．当第一个有色带到达柱底时，并且没有流出之前，关闭活塞，倒空锥形
瓶，打开活塞，收集全部色带。然后，改用ethyl acetate : petroleum ether (1:1)作为洗脱剂。关闭活塞，换一个空的且干净的锥形瓶，打开活塞。
当第二个有色带到达柱底时，并且没有流出之前，关闭活塞，倒空锥形
瓶，打开活塞，收集全部色带。柱层析分离结束。
8．柱层析分离结束后，采用tlc对上述分离的两个溶液进行分析，总结分
离效果。同时，打开层析柱活塞，在加压下让展开剂流干，然后将硅胶
倒入指定的固体废物桶中。切勿倒入水槽或普通垃圾桶。
预习时的问题
1.在薄层层析实验中，为什么点样的样品斑点不可浸入展开剂的溶液中？为什么进行薄层层析时展缸要盖上盖？
2.当用混合物进行薄层层析时，如何判断各组分的在薄层板上的位置？靛红与偶氮苯，哪一个的极性较强？为什么？
3.柱层析时柱中若留有空气或者是填装不均匀，对分离效果有何影响？如何避免？
4.偶氮苯和靛红物理化学性质？毒性？有什么应用？偶氮苯光照异构化的机理？why is trans-azobenzene more stable than cis-azobenzene?
其它阅读材料
1.光化学
由光的作用引起的化学反应近年来日益受到人们的重视，光合作用就是最重要的光化学反应。研究激发态分子化学行为的光化学反应已经成为有机化学的一个重要分支。光不仅可以引起多种多样的化学反应，合成各种前所未有的奇妙反应分子，而且与我们的日常生活及生命现象有着密切的联系。
2. 薄层色谱
1. 固定相的选择
氧化铝和硅胶是薄层层析色谱常用的固定相。氧化铝多用于分离碱性或中性有机物；而硅胶的吸附性源于表面的si-oh基，主要用于分离酸性、中性有机物质。
薄层色谱用的硅胶有薄层色谱用的硅胶有60g、6ogf254、60h、60hf254和60hf254+366等类型，其中g表示含有13％硫酸钙（作为黏合剂）；h表示不含硫酸钙；f254表示含有2％无机荧光物质，在254 nm的紫外光照射下发出绿色荧光。与硅胶相似，氧化铝也因含有黏合剂或荧光剂而分为氧化铝h、氧化铝g、
氧化铝hf254和氧化铝gf254等类型。黏合剂除硫酸钙外，还可用淀粉、羧甲基纤维素（cmc)。
2. 操作方法
①点样
在薄层板一端约1cm处，用铅笔轻轻划一条作为起点线。样品用易挥发性溶剂溶解后，用毛细管吸取样品溶液，轻轻接触到起点线的某一位置上。如果溶液太稀，可多点几次，但要等第一次样品溶剂挥发后，再点第二次。
点好样品后，待溶剂挥发干净，才可以进行下面的展开过程。
②展开剂的选择
选择展开剂，首先应考虑对被分离物有一定的溶解度和解吸能力。由于硅胶和氧化铝都是极性吸附剂，所以展开剂的极性越大，试样在薄板上移动的距离越远，rf值（rf值是一个化合物在薄层板上上升的高度与展开剂上升的高度的比
值）越大。例如，在分离过程中常发现rf太小，说明展开剂极性不够，需要考
虑加入一种极性强的展开剂进行调控。发现rf值太小，说明展开剂极性不够，
需要考虑加入一种极性强的展开剂进行调控。
常用展开剂的洗脱力由小到大的顺序为：石油醚、环己烷、四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙醋、丙酮、正丁醇、乙醇、甲醇、水、冰乙酸、吡啶、有机酸等。
此外，在展开过程中，展开缸内展开剂的蒸气须始终处于饱和状态。一般可用一块方型滤纸贴于缸壁上（下端浸于展开剂中），盖好密封一段时间。取放薄层板应迅速。
③显色篇三：柱层析知识总结
柱层析知识总结
柱层析实验报告4
柱层析
利用层析柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱层析。柱层析是层析技术中的一类，依据其作用原理又可分为吸附柱层析、分配柱层和离子交换柱层析等。其中以吸附柱层析应用最广。以下只介绍吸附柱层析的相关问题，其操作方法也可作为其他类型柱层析的参考。
1.吸附柱层析的器材
(1)层析柱
实验室中所用的玻璃层析柱有两种形式：一是下部带有活塞的玻璃管，活塞的芯最好是聚四氟乙烯制作的，这样可以不涂真空油脂，以免污染产品。如果使用普通的玻璃活塞，则真空油脂要小心地涂薄涂匀。另一种是将玻璃管下端拉细，套上一段弹性良好的管子。这段管子必须是不能被淋洗剂溶解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因为橡皮易被氯仿、苯、thf等溶剂溶胀，而聚乙烯管子对大多数溶剂是惰性的，所以常常使用。用一只螺旋夹控制流速，此外，薄膜塑料柱因使用方便、节省淋洗剂、减少蒸发量等优点，应用日趋广泛。薄膜塑料柱总是以扁平成卷保存的，两侧常有很深的折痕。使用前需将裁取的一段薄膜管一端扎紧，另一端套在一段玻璃管上并用棉线扎紧。将这段玻璃管穿过一个单孔塞。然后将薄膜管放进一根又粗又长，下端拉细了的玻璃管内，使塞子塞紧大玻璃管的口。用水泵自大玻璃管下端抽气，薄膜柱即因内部压强大于外部而自行展圆。待装入吸附剂后在其下部扎几个小孔即可使用。
层析柱的尺寸根据被分离物的量来确定，其直径与高度之比则根据被分离混合物的分离难易而定，一般在1∶8到1∶50之间。柱身细长，分离效果好，但可分离的量小，且分离所需时间长；柱身短粗，分离效果较差，但一次可以分离较多的样品，且所需时间短。如果待分离物各组分较难分离，宜选用细长的柱子，如果要处理大量的较易分离的或对分离纯度要求较低的混合物，则可选用粗而短的柱子。最常使用的层析柱，直径与长度之比在1∶8 到1∶15 之间。
(2)吸附剂
柱层析中最常使用的吸附剂是氧化铝或硅胶。其用量为被分离样品的30～50倍，对于难以分离的混合物，吸附剂的用量可达100倍或更高。对于吸附剂应综合考虑其种类、酸碱性、粒度及活性等因素，最后用实验方法选择和确定。
市售氧化铝有酸性、碱性和中性之分。酸性氧化铝是用1%盐酸浸泡后，用蒸馏水洗到其浸出液的ph值为4，适用于分离酸性物质；碱性氧化铝浸出液的ph值为9～10，用以分离胺类、生物碱及其他有机碱性化合物。中性氧化铝的相应ph值为7.5，适合于醛、酮、醌、酯等类化合物的分离以及对酸、碱敏感的其他类型化合物的分离。硅胶没有酸碱性之分，可适用于各类有机物的分离。
柱层析所用氧化铝的粒度一般为100～150目，硅胶为60～100目，如果颗粒太小，淋洗剂在其中流动太慢，甚至流不出来。
氧化铝和硅胶的活性各分五个等级。哪个活性级别分离效果最好，要用实验方法确定，而不是盲目选择高的活性级别，最常使用的是ⅱ～ⅲ级。如果吸附剂活性太低，分离效果不好，可通过”活化”来提高其活性。所谓”活化”就是指用加热的方法除去吸附剂所含的水分，提高其吸附活性的过程。通常是将吸附剂装在瓷盘里放进烘箱中恒温加热。”活化”的温度和时间应根据分离需要而定。氧化铝一般在200℃恒温4h，硅胶在105～110℃恒温0.5～1h。”活化”完毕，切断电源，待温度降至接近室温时，从烘箱中取出放进干燥器中备用。有的样品在活性高的吸附剂中分离效果不好，可将吸附剂放在空气中让其吸收一些水分，分离效果反而好一些。
此外，一些天然产物带有多种官能团，对微弱的酸碱性都很敏感，则可用纤维素、淀粉或糖类作吸附剂。活性碳是一种吸附能力很高的吸附剂，但因粒度太小而不常用。
(3)淋洗剂
淋洗剂是将被分离物从吸附剂上洗脱下来所用的溶剂，所以也称为洗脱剂或简称溶剂。其极性大小和对被分离物各组分的溶解度大小对于分离效果非常重要。如果淋洗剂的极性远大于被分离物的极性，则淋洗剂将受到吸附剂的强烈吸附，从而将原来被吸附的待分离物”顶替”下来，随多余的淋洗剂冲下而起不到分离作用；如果淋洗剂的极性远小于各组分的极性，则各组分被吸附剂强烈吸附而留在固定相中，不能随流动相向下移动，也不能达到分离的目的。如果淋洗剂对于被分离物各组分溶解度太大，被分离物将会过多、过快地溶解于其中并被迅速洗脱而不能很好地分离；如果溶解度太小，则会造成谱带分散，甚至完全不能分开。常用溶剂的极性大小次序也因所用吸附剂的种类不同而不尽相同，很多资料给出了在硅胶和氧化铝柱中常用溶剂所表现出的极性次序，可作为选择溶剂的参考，首先在薄层层析板上试选，初步确定后再上柱分离。如果所有色带都行进甚慢则应改用极性较大溶解性能也较大的溶剂，反之则改用极性和溶解性都较小的溶剂，直至获得满意的分离效果。
除了分离效果外还应当考虑：①在常温至沸点的温度范围内可与被分离物长期共存不发生任何化学反应，也不被吸附剂或被分离物催化而发生自身的化学反应；②沸点较低以利回收；③毒性较小，操作安全；④适当考虑价格是否合算，来源是否方便；⑤回收溶剂一般不应作为最终纯化产物的淋洗剂。
淋洗剂的用量往往较大，故最好使用单一溶剂以利回收。只有在选不出合适的单一溶剂时才使用混合溶剂。混合溶剂一般由两种可以无限混溶的溶剂组成，先以不同的配比在薄层板上试验，选出最佳配比，再按该比例配制好，像单一溶剂一样使用。如果必须在层析过程中改变淋洗剂的极性，不能把一种溶剂迅速换成另一种溶剂，而应当将极性稍大的溶剂按一定的百分率逐渐加到正在使用的溶剂中去，逐步提高其比例，直至所需要的配比。一条经验规律称为”幂指数增加”，例如，原淋洗剂为环己烷，如欲加入二氯甲烷以增加其极性，则不应立即换为二氯甲烷，而应使用这两种溶剂的混合液，其中二氯甲烷的比例依次为5%，15%，45%，最后再换为纯净的二氯甲烷。每次加大比例后，须待流出液量为吸附剂装载体积的3倍时再进一步加大比例。这只是一般方法，其目的在于避免后面的色带行进过快，追上前面的色带，造成交叉带。但如果两色带间有很宽阔的空白带，不会造成交叉，则亦可直
接换成后一种溶剂，所以应根据具体情况灵活运用。
(4)被分离的混合物
在实际工作中，被分离的样品是不能选择的，但认真考察各个组分的分子结构，估计其吸附能力，对于正确选择吸附剂和淋洗剂都是有益的。若化合物的极性较大，或含有极性较大的基团，则易被吸附而较难被洗脱，宜选用吸附力较弱的吸附剂和极性较大的淋洗剂。反之，对于极性较小的样品则选用极性较强的吸附剂和弱极性或非极性淋洗剂。若各组分极性差别较大，则易于分离，可选用较为短粗的柱子，使用较少的吸附剂；若各组分极性相差甚微，则难于分离，宜选用细长的柱子并使用较大量的吸附剂。
(5)其他物品
储存淋洗剂的分液漏斗一只，接收洗出液的锥形瓶若干只，其容积大小根据淋洗剂的体积确定。玻璃毛少量，白沙少量，各自洗净烘干。若层析柱很小，也可用少量脱脂棉代替玻璃毛。
2.吸附柱层析的操作
(1)装柱
装柱的方法分湿法和干法两种。
湿法装柱时，将柱竖直固定在铁支架上，关闭活塞，加入选定的淋洗剂至柱容积的1/4 ，用一支干净的玻璃棒将少量玻璃毛(或脱脂棉)轻轻推入柱底狭窄部位，小心挤出其中的气泡，但不要压得太紧密，否则淋洗剂将流出太慢或根本流不出来。将准备好的白沙加入柱中，使在玻璃毛上均匀沉积成约5mm厚的一层。将需要量的吸附剂置烧杯中，加淋洗剂浸润，溶胀并调成糊状。打开柱下活塞调节流出速度为每秒钟1滴，将调好的吸附剂在搅拌下自柱顶缓缓注入柱中，同时用套有橡皮管的玻璃棒轻轻敲击柱身，使吸附剂在淋洗剂中均匀沉降，形成均匀紧密的吸附剂柱。吸附剂最好一次加完。若分数次加，则会沉积为数层，各层交接处的吸附剂颗粒甚细，在分离时易被误认为是一个色层。全部吸附剂加完后，在吸附剂沉积面上盖一层白沙(如柱很小，也可不用白沙而盖上一张直径与柱内径相当的滤纸片)，关闭活塞。在全部装柱过程及装完柱后，都需始终保持吸附剂上面有一段液柱，否则将会有空气进入吸附剂，在其中形成气泡而影响分离效果。如果发现柱中已经形成了气泡，应设法排除，若不能排除，则应倒出重装。装好的吸附柱各层材料的分布见图3-36。
干法装柱时，先将柱竖直固定在铁支架上，关闭活塞。加入溶剂至柱容积的3/4，打开活塞控制溶剂流速为1滴/秒，然后将所需量的吸附剂通过一支短颈玻璃漏斗慢慢加入柱中，同时，轻轻敲柱身使柱填充紧密。干法装柱的缺点是容易使柱中混有气泡。特别是使用硅胶为吸附剂时，最好不用干法装柱，因为硅胶在溶剂中有一溶胀过程，若采用干法装柱，硅胶会在柱中溶胀，往往留下缝隙和气泡，影响分离效果，甚至需要重新装柱。
装填薄膜塑料柱时，可先用抽气法将薄膜展开成圆柱形，在底部装入一段玻璃毛，吸附剂通过一个粗颈漏斗自柱顶装入。装至1/3处，将柱身在坚硬的表面上礅结实，再装入1/3，
再礅结实，直至装到需要的高度。装成的薄膜柱应紧密结实，可以像玻璃柱那样用夹子夹住，再在其底部扎一些小孔即可使用。(2)加样
加样亦有干法、湿法两种。湿法加样是将待分离物溶于尽可能少的溶剂中，如有不溶性杂质应当滤去。打开柱下活塞小心放出柱中液体至液面下降到滤纸片处，关闭活塞，将配好的溶液沿着柱内壁缓缓加入，切记勿冲动吸附剂，否则将造成吸附剂表面不平而影响分离效果。溶液加完后，小心开启柱下活塞，放出液体至溶液液面降至滤纸片时，关闭活塞，用少许溶剂冲洗柱内壁(同样不可冲动吸附剂)，再放出液体至液面降到滤纸处，再次冲洗柱内壁，直至柱壁和柱顶溶剂没有颜色。加样操作的关键是要避免样品溶液被冲稀。在技术熟练的情况下，也可以不关下部活塞，在每秒钟1滴的恒定流速下连贯地完成上述操作。
干法加样是将待分离样品加少量低沸点溶剂溶解，再加入约5倍量吸附剂，拌和均匀后在通风橱中蒸发至干。揭去柱顶滤纸片，将吸附了样品的吸附剂平摊在柱内吸附剂的顶端，在上面加盖滤纸片或加盖一层白沙。干法加样易于掌握，不会造成样品溶液的冲稀，但不适合对热敏感的化合物。
(3)淋洗和接收
样品加入后即可用大量淋洗剂淋洗。随着流动相向下移动，混合物逐渐分成若干个不同的色带，继续淋洗，各色带间距离拉开，最终被一个个淋洗下来。当第一色带开始流出时，更换接收瓶，接收完毕再更换接受瓶，接受两色带间的空白带，并依此法分别接收各个色带。若后面的色带下行太慢，可依次使用几种极性逐渐增大的淋洗剂来淋洗。为了减少添加淋洗剂的次数，可用分液漏斗在柱顶”自动”添加。分液漏斗的活塞打开，顶塞密封，尾部插进柱上部的淋洗剂液面以下，当液面下降后，漏斗尾部露出，即有空气泡自尾部进入分液漏斗，这就加大了漏斗内液面上的压力，漏斗内的淋洗剂就自动流入柱内，使柱内液面上升，当液面淹没漏斗尾部时，就不再有空气进入漏斗，漏斗内的淋洗剂就不再流出。在使用薄膜塑料柱进行层析时，一旦色带形成并拉开距离，可将柱吸干，用刀沿”空白带”处切开，将各色带分别萃取，各自蒸去溶剂，即得到相应组分的化合物。
(4)显色
分离无色物质时需要显色。如果使用带萤光的吸附剂，可在黑暗的环境中用紫外光照射以显出各色带的位置，以便按色带分别接收。但柱上显色远不如在薄层板上显色方便。所以常用的办法是等分接收，即事先准备十几个甚至几十个接收瓶，依次编出号码，各接收相同体积的流出液，并各自在薄层板上点样展开，然后在薄层板上显色(相关的显色操作见薄层层析部分)。具有相同rｆ值的为同一组分，可以合并处理。也可能出现交叉带，若交叉带很少，可以弃之，若交叉带较多，或样品很贵重，可以将交叉部分再次作柱层析分离，直至完全分开。
3.柱层析操作中应注意的问题
(1)要控制淋洗剂流出的速度。一般控制流速为1滴/秒。若流速太快，样品在柱中的吸附和溶解过程来不及达到平衡，影响分离效果。若流速太慢，分离时间会拖得太长。有时，
样品在柱中停留时间过长，可能促成某些成分发生变化。或流动相在柱中下行速度小于样品的扩散速度，会造成色带加宽、交合甚至根本不能分离。
(2)以下现象会严重影响分离效果，必须尽力避免。
a.色带过宽，界限不清。造成的原因可能是柱的直径与高度比选择不当，或吸附剂、淋洗剂选择不当，或样品在柱中停留时间过长。但更常见的却是在加样时造成的。若在样品溶液加进柱中后，没有打开下部活塞放出淋洗剂使样品溶液降至滤纸片处，即急于加溶剂冲洗柱壁，造成样品溶液大幅度稀释，或过早加大量溶剂淋洗，必然会造成色带过宽。所以溶样时一定要使用尽可能少的溶剂，加样时一定要避免样品溶液的稀释。
b.色带倾斜。正常情况下柱中的色带应是水平的，而倾斜的色带，在前一个色带尚未完全流出时，后面色带的前沿已开始流出，所以不能接收到纯粹的单一组分。造成色带倾斜的原因是吸附剂的顶面装得倾斜，或柱身安装得不垂直。
c.气泡。造成气泡的原因可能是玻璃毛或脱脂棉中的空气未挤净，其后升入吸附剂中形成气泡，也可能是吸附剂未充分浸润溶胀，在柱中与淋洗剂作用发热而形成，但更大量的是在装柱或淋洗过程中淋洗剂放出过快，液面下降到吸附剂沉积面之下，使空气进入吸附剂内部滞留而成。当柱内有气泡时，大量淋洗剂顺气泡外壁流下，在气泡下方形成沟流，使后一色带前沿的一部分突出伸入前一色带，从而使两色带难于分离。所以在装柱及淋洗过程中应始终保持吸附剂上面有一段液柱。
d.柱顶面填装不平。这时色带前沿将沿低凹处向下延伸进入前面的色带，这也是一种沟流。
e.断层和裂缝。当柱内某一区域内积有较多气泡时，这些气泡会合并起来在柱内形成断层或裂缝。裂缝造成的沟流，而断层相当于一个不平整的装载面。
柱层析实验报告5
柱层析分离色素
一、【实验目的】
1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。
2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。
二、【实验原理】
叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。 吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。
本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。
三、【实验材料】
原料：
新鲜的菠菜叶
试剂 ：
1． 无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝
2． 石英砂 6．饱和氯化钠溶液
3． 丙酮 7.水硫酸钠
4． 石油醚（60-90℃） 8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材 ：
层析柱（1×30cm）， 研钵， 蒸馏装置，
脱脂棉， 天平， 烧杯， 过滤漏斗，
玻璃棒， 锥形瓶， 分液漏斗， 试管 ，
铁架台
四、【实验操作】
1． 色素的提取：
20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入40毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用.
2．样品的浓缩：
将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8毫
升左右，以备加样使用。
3．层析拄的制备：
15克碱性三氧化二铝加入30毫升石油醚搅拌，浸泡10min.。在层
析拄内加入一团棉花在底部，再加入石英砂0.5cm以上，然后用石油醚半充满柱子，再将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内，倒时应该缓慢，重复使用下面的石油醚，直到装完。用石油醚洗柱内壁，顶部加一小团棉花，然后再填入石英砂0.5厘米高。
3．样品的分离层析：吸附层析分离色素
打开层析拄下部开关，向拄内加入2毫升浓缩液，至液体没入砂内，
再加入石油醚冲洗拄壁，液体浸入砂内，加洗脱液开始层析，可以看到不同色带如图片1，直至第一条色带洗脱完毕，在拄下面用试管接收第一条色带的洗脱液，如图片2。
五、【实验结果】
实验结果如下图：
图一：层析柱中出现黄色带
图二：提取出的黄色胡萝卜素
结果分析：
洗脱过程中，首先有一条黄色的色带圈沿着层析柱下移，色带圈的各个方向的移动速度并不是完全相同，原因在于层析柱的制作过程并不完全均一，使层析柱内部不均匀，以至于色带各方向的移动速度不同。最后收集得到亮黄色的胡萝卜素。
七、【注意事项】
1、萃取时不要剧烈振荡，以防止发生乳化现象。
2、为了保持柱子的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的，否则当柱中溶剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗透和显色的均一性。因此要保证整个装样过程中溶剂要高于三氧化二铝的表面。
3、在吸附剂上端加入脱脂棉（或滤纸）是使加样品时不致把吸附剂冲起；在吸附柱下端加脱脂棉（或沙子）可以防止吸附剂细粒流出。
4、层析柱填装紧密与否，对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀，会影响渗透速度和显色的均匀。
6、洗脱流速不宜过快，避免因此压紧凝胶，色素分离不开；也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降，色素洗脱很慢。因此应控制洗脱流速，以每分钟60~80滴为宜。
7、样品一定要足够浓缩，加样量不要过大，过大，分离条带过宽，如果层析拄不够长，各组分不易分开，易同时洗脱下来；加样量过少，色带不是很清楚，不易观察，效果不好。
8、层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生”管壁效应”，即柱管中心部分的组份移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。
八、【实验小结】
在该柱层析分离色素实验中，我了解了柱层析技术的相应方法和原理，学会了层析柱的制作和准备，进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质、洗脱液的配比、层析柱的制作及洗脱液的流速是本实验成功与否的三大关键因素。
知识拓展：
1、溶剂的选择：
（1）吸附剂要求较纯，否则会影响样品的吸附和洗脱。
（2）溶剂和吸附剂不能起化学反应。
（3）溶剂的极性应比样品小，如果大了，样品不宜被吸附剂吸附。
（4）溶剂对样品的溶解度不能太大，否则影响吸附，但也不能太小，溶液的体
积增加，易使色谱分散。
（5）可使用混合溶剂，如有的组分含有较多的极性基团，在极性小的溶剂中溶
解度太小。也可选用极性大的溶剂溶解，然后加入一定量的非极性溶剂。这样既降低了极性，又减少了溶液的体积。
2、洗脱剂的选择：
样品吸附在氧化铝柱上后，用合适的溶剂进行洗脱，这种溶剂称为洗脱剂。如果原来用于溶解样品的溶剂冲洗柱不能达到分离的目的，可以改用其他溶剂，一般极性较强的溶剂影响样品和氧化铝之间的吸附，容易将样品洗脱下来，达不到分离的目的。
因此常用一系列极性渐次增强的溶剂，既先使用极性最弱的溶剂，然后加入不同比例的极性溶剂配成洗脱溶剂。常用的洗脱溶剂的极性按如下次序递增。 己烷和石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜三氯乙烯＜二硫化碳＜甲苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜丙醇＜乙醇＜甲醇＜水＜吡啶＜乙酸。篇二：实验六：薄层层析与柱层析
以上就是柱层析实验报告相关范本，希望可以帮助到您，关注小编，更多生化实验报告等你参考。
本内容由yuying收集整理，不代表本站观点，如果侵犯您的权利，请联系删除（点这里联系），如若转载，请注明出处：https://wenku.puchedu.cn/17581.html
